Наблюдение за ВИЧ-инфекцией из клеток: исследование показывает последнюю роль белка с названием ALIX

Наблюдение за ВИЧ-инфекцией из клеток: исследование показывает последнюю роль белка с названием ALIX

Anonim

Исследователи из Университета штата Юта разработали способ наблюдения за появлением новых частиц вируса СПИДа или «почкованием» из инфицированных человеческих клеток, не мешая процессу. Метод показывает, что белок с именем ALIX участвует во время заключительных этапов репликации вируса, а не ранее, как считалось ранее.

«Мы наблюдаем за одной ячейкой за раз» и используем цифровую камеру и специальный микроскоп, чтобы снимать фильмы и фотографии начинающего процесса, - говорит вирусолог Савез Сафарян, доцент физики и астрономии, старший автор нового исследования по вопросам ВИЧ-инфекции онлайн сегодня в журнале Public Library of Science PLOS ONE.

«Мы впервые увидели, что ALIX вербуется в начинающие ВИЧ-инфицированные», - говорит он. «Все знали, что ALIX занимается просвещением в связи с ВИЧ, но никто не мог представить себе вербовку ALIX в этот процесс».

Находка «фундаментальная фундаментальная наука» и не имеет немедленного клинического значения для пациентов со СПИДом, потому что ALIX участвует в слишком многих важных функциях, таких как деление клеток, как вероятная цель для новых лекарств, говорит Саффар.

«Мы знаем много о белках, которые помогают ВИЧ выйти из клетки, но мы не знаем, как они собираются вместе, чтобы помочь вирусу выбраться, и в ближайшие 10-20 лет нам будет очень много известно больше об этом механизме », - добавляет он. «Будет ли это лекарственной мишенью? Будет ли это частью биохимии, используемой в терапевтической или биотехнологической промышленности позже? Я не могу сказать вам сейчас. Но если бы это было не из-за нашего любопытства как вида, мы бы не имели технологии, которые у нас есть сегодня ».

Новое исследование «- хорошая работа», - говорит эксперт по вопросам ВИЧ-инфекции Буес-Сундквист, который консультировал Саффариана и является профессором и со-председателем биохимии в Медицинском университете Университета штата Юта. «Это действительно интересно для тех из нас, кто изучает механизм сборки ВИЧ».

Исследование финансировалось Национальным научным фондом. Саффариан провел исследование с первым автором, Пей-И Ку, докторантом Университета штата Юта по физике; Мурад Бендженнат, попечитель по физике и астрономии; техник Джефф Баллев; и Майклом Ландесманом, еще одним докторантом по физике и астрономии, который ранее работал в лаборатории биохимии Сундквиста.

Наблюдайте, не трогайте, как ВИЧ-почки

Биохимические методы, используемые в течение многих лет, включают сбор миллионов вирусов в лабораторной посуде и проведение различных анализов, чтобы выявить белки, которые составляют вирус, например, с использованием антител, которые связываются с определенными белками и с использованием других белков, которые делают первые белки флуоресцируют, чтобы они можно увидеть.

«Вы не делаете этого по одному вирусу за раз, - говорит Саффариан. «Проблема заключается в том, что вы не видите различий между подобными вирусами. И вы не видите времени, как различные белки приходят и уходят, чтобы помочь вирусу выбраться из клетки».

Другие методы замораживают или иным образом фиксируют клетки, когда появляются новые частицы ВИЧ, и используют электронный микроскоп, чтобы сфотографировать эти изображения с замораживанием кадра вирусной репликации. Саффариан также использует технологию, известную как «полная флуоресцентная микроскопия внутреннего отражения», которая используется для изучения динамических процессов в клетках.

Ранее этот метод использовался для создания изображений почкования ВИЧ и аналогичного конского вируса EIAV. Но Саффариан говорит, что исследование не показало, что ALIX участвует в ВИЧ-инфекции и имеет недостатки, которые ошибочно указывают на то, что белок ALIX был вовлечен довольно рано в процесс подавления EIAV, что указывает на то, что он сделал то же самое в отношении ВИЧ-инфицирования.

Ку, Саффариан и его коллеги объединили этот метод микроскопии с улучшенным способом генетического связывания зеленой флуоресцентной «метки» с белками ALIX в клонированных клетках, чтобы они могли видеть белки, не нанося вреда их нормальной функции. Исследователи пробовали многочисленные так называемые «линкеры» и нашли тот, который позволил им увидеть белки ALIX, поскольку они участвовали в ВИЧ-инфекции, но не нарушали этот процесс.

Ни технология микроскопа, ни маркировка белков с зеленой флуоресценцией не являются новыми, но «то, что мы сделали, это новое, мы связали эти белки флуоресценции с ALIX, используя множество разных линкеров», чтобы найти тот, который позволяет белку ALIX работать правильно, добавляет он.

Проблема с более ранними исследованиями, которая указывала на то, что ALIX была вовлечена в начале процесса почкования, заключалась в том, что использовался только один линкер, и это нарушало нормальную функцию ALIX, говорит Саффар.

Глядя на белки, формирующие ВИЧ

Когда ВИЧ реплицируется внутри клетки человека, белок, названный Gag, составляет большинство новых частиц - в одной частицах ВИЧ имеется 4000 копий белка Gag, хотя в процесс участвует пучок других белков, включая ALIX, который стоит для «белка, взаимодействующего с alg-2». Эксперименты, подобные работе команды Саффариана, используют «вирусоподобные частицы», которые являются ВИЧ-инфицированными, лишенными своего генетического плана или генома, поэтому они не представляют риск заражения в лаборатории.

«Вирусные частицы сохраняют ту же самую геометрию и тот же процесс почкования, что и инфекционный ВИЧ», - говорит Саффариан.

Во время почкования белки Gag собираются на внутренней стороне клеточной мембраны - вместе с ALIX на поздних стадиях - и образуют новую часть ВИЧ, которая вытесняет свой путь из клетки - процесс, посредством которого СПИД в инфицированном человеке распространяется от клетки к клетка.

Чтобы посмотреть на процесс почкования, Ку, Саффариан и его коллеги помещают человеческие клетки HELA, содержащие частицы в небольшом количестве жидкой среды роста в чашке Петри, и помещают ее под микроскоп, который находится в стеклянной камере, поддерживаемой при температуре тела, поэтому клетки могут оставаться живыми более 48 часов. Твердый синий лазер нацелен на образец, чтобы зелено-меченные ALIX и красно-меченные белки Gag светились или флуоресцировали, чтобы их можно было увидеть, когда они собираются в вирусную частицу.

С красными мечеными белками Gag и зелеными мечеными белками ALIX «мы могли видеть, что ALIX приходят в конце сборки вирусной частицы», причем около 100 белков ALIX сходится с примерно 4000 молекул Gag и собирается в новую частицу ВИЧ, Затем ALIX вводит два других белка, которые вырезают пропущенную вирусную частицу из клетки, когда она возникает. Положение ALIX во время скрещивания новых частиц ранее не было признано, говорит Саффар

Исследователи наблюдали за тем, как вирусные частицы зарождались из одной клетки за один раз: обычно около 100 из них возникали в течение двухчасового периода. Саффариан говорит, что большинство белков ALIX ушли, когда сборка ВИЧ была завершена и возвращена в жидкость внутри клетки.

Он говорит об открытии, что ALIX не участвует в поздних стадиях ВИЧ-положительного ответа, свидетельствует о существовании ранее неизвестного механизма вируса, который регулирует время ALIX и других белков при сборке новых частиц ВИЧ.

«Мы обнаружили, что клеточные компоненты, которые помогают с выпуском вируса, действительно поступают в гораздо более сложную схему синхронизации, чем прогнозируется на основе биохимических данных», - говорит Саффар. «Результаты этого исследования являются многообещающими, поскольку он раскрывает новый регуляторный механизм для набора клеточных компонентов на сайты, отдающие предпочтение ВИЧ, и открывает двери для захватывающих будущих исследований по механизму отчуждения ВИЧ».

Физики в вирусологии

Почему физики изучают вирусы? Во-первых, биофизики изучают физические механизмы в биологии, такие как двигатели в клетках. Саффариан получил докторскую степень по биофизике, разработав методы, которые использовали флуоресцентный свет для изучения клеточных процессов.

«Я очень завидую, потому что каждый раз, когда я участвовал в проекте, я чувствовал, что настоящая наука - это преследование кого-то другого», - говорит он. «Я помогал им с инструментами, но сам не задавал основополагающих вопросов».

Поэтому Саффариан сделал постдокторское общение в клеточной биологии в Гарвардской медицинской школе, затем «решил, что я хочу изучать вирусы, как они выходят из клеток и реплицируются». В дополнение к своему положению в физике он является адъюнкт-доцентом биологии.

Популярные посты

Рекомендуем